1

Изучен процесс биосинтеза бактериальной целлюлозы (БЦ) на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала мискантуса. Лигноцеллюлозный материал получен обработкой мискантуса разбавленным раствором азотной кислоты на опытном производстве. Ферментативный гидролиз осуществлён в ферментере объёмом 11 л. Биосинтез БЦ проведён с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12. Установлено, что численность уксуснокислых бактерий в процессе культивирования в 1,2 раза меньше, чем дрожжей. Основная утилизация субстрата происходит за 6 суток культивирования, константа утилизации субстрата составляет 0,234 сут-1. Показано, что ферментативный гидролизат лигноцеллюлозного материала мискантуса не является доброкачественной питательной средой для биосинтеза БЦ, выход БЦ составил 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход на синтетической питательной среде. Установлено, что бактериальная целлюлоза, полученная на данной среде, является химически чистой.

бактериальная целлюлоза

Мedusomyces gisevii

инфракрасная спектроскопия

ферментативный гидролизат

мискантус

1. Бактериальная целлюлоза, синтезируемая Gluconacetobacter hansenii, для использования в медицине / Т.И. Громовых и [др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2017. – Т. 53, № 1. – С. 69–75.

2. Перспективы применения бактериальной целлюлозы в мясопродуктах / Т.И. Громовых и [др.] // Мясная Индустрия. – 2013. – № 4. – C. 32–35.

3. Octave S. Biorefinery: toward an industrial metabolism / S. Octave, D. Thomas // Biochimie. – 2009. – № 91. – P. 659–664.

4. Gismatulina Y.A., Budaeva V.V., Sakovich G.V., Veprev S.G., Shumny V.K. Cellulose from various parts of soranovskii miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. – 2015. – Vol. 5, № 1. – Р. 60–68.

5. Гисматулина Ю.А. Сравнение физико-химических свойств целлюлоз, полученных комбинированным способом из листа и стебля мискантуса / Ю.А. Гисматулина / Вестник алтайской науки. – 2014. – № 1 (19). – С. 302–307.

6. Макарова Е.И. Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК: дис. … канд. технич. наук. – Щелково, 2015. – 161 с.

7. Гладышева Е.К. Особенности структурных характеристик бактериальной целлюлозы, синтезированной на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала плодовых оболочек овса / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба, Л.А. Алешина // Ползуновский вестник. – 2016. – № 4–1. – С. 152–156.

8. Skiba E.A., Budaeva V.V., Baibakova O.V., Udoratina E.V., Shakhmatov E.G., Shcherbakova T.P., Kuchin A.V., Sakovich G.V. Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Materials in Aqueous Media and the Subsequent Microbiological Synthesis of Bioethanol // Catalysis in Industry. – 2016. – Vol. 8, № 2. – Р. 168–175.

9. Cкиба Е.А. Методика определения биологической доброкачественности гидролизатов из целлюлозосодержащего сырья с помощью штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1693 / Е.А. Cкиба // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2016. – № 1 (16). – С. 34–44.

10. Гладышева Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2015. – № 3. – С. 149–156.

11. Гладышева Е.К. Исследование влияния температуры на синтез бактериальной целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева // Современные наукоемкие технологии. – 2016. – № 8–1. – С. 36–40.

12. Юркевич Д.И. Медузомицет (Чайный гриб): научная история, состав, особенности физиологии и метаболизма / Д.И. Юркевич, В.П. Кутышенко // Биофизика. – 2002. – № 6. – С. 1116–1129.

13. Yang, X.-Y., Huang C., Guo H.-J., Xiong L., Li Y.-Y., Zhang H.-R., Chen X.-D. Bioconversion of elephant grass (Pennisetum purpureum) acid hydrolysate to bacterial cellulose by Gluconacetobacter xylinus // Journal of Applied Microbiology. – 2013. – № 115. – Р. 995–1002.

14. Яровенко В.Л. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов. – М.: Колос, 1999. – 464 с.

15. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Ч. ΙΙ. – СПб.: НПО «Профессионал», 2006. – 1142 с.

Масштабирование процесса и реализация на практике биотехнологического производства зависит от таких факторов, как наличие воспроизводимого массового дешевого сырья; простота трансформации сырья в питательную среду; возможность аппаратурного оформления производства стандартным либо новым эффективным оборудованием; высокий выход целевого продукта и обеспечение стандартности его качества. Ввиду перспективности использования БЦ в различных областях необходимо создание ее промышленного производства, при этом важной задачей является поиск подходящих источников углерода, имеющих низкую стоимость и не конкурирующих с пищевой продукцией. Актуальным направлением получения БЦ является использование целлюлозосодержащего сырья для получения из него альтернативных питательных сред.

Массовое использование ископаемых ресурсов в течение прошлого столетия и связанная с этим проблема загрязнения вызвали значительное число экологических и экономических проблем. Предположительно, эти ресурсы будут исчерпаны в ближайшем будущем. Данные причины способствуют прогрессивному переходу к экономике на основе возобновляемых материалов (биомассы) в качестве сырья для производства химических веществ, материалов, топлива и энергии в пределах так называемой концепции биоконверсии. Целлюлоза является одним из наиболее распространенных полисахаридов и рассматривается как неисчерпаемый и универсальный источник. Перспективным является использование так называемых энергетических, т.е. быстрорастущих растений: мискантуса, проса, сорго и т.д. . Мискантус - род многолетних травянистых растений семейства мятликовых. Представляет растение высотой до 200 см, стебли прямостоячие, листья простые пластинчатой формы, верхушка острая, основание клиновидное, соцветия в виде метелок. Растение является многолетним злаком и начиная с третьего года культивирования может ежегодно продуцировать на одном поле на протяжении 15-20 лет 10-15 т/га/год сухой биомассы, что соответствует 4-6 т/га чистой целлюлозы .

В ИПХЭТ СО РАН разработана технология получения ферментативных гидролизатов из мискантуса. Предварительно мискантус подвергают химической обработке разбавленными растворами кислоты и/или щелочи , а затем ферментативному гидролизу . Исследование процесса биосинтеза БЦ на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного материала плодовых оболочек овса показало, что для успешного микробиологического синтеза ферментативный гидролизат должен обладать биологической доброкачественностью.

В данной работе в качестве субстрата для ферментативного гидролиза выбран лигноцеллюлозный материал (ЛЦМ) мискантуса. ЛЦМ мискантуса получают обработкой сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты при атмосферном давлении в стандартном оборудовании. Показано, что ферментативный гидролизат, полученный из ЛЦМ мискантуса, является биологически доброкачественным для биосинтеза этанола и не нуждается в дополнительной технологической обработке для освобождения его от вредных примесей .

Целью данной работы являлось изучение процесса биосинтеза БЦ на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса и исследование структуры полученных образцов методом инфракрасной спектроскопии. Следует отметить, что данная задача неоднозначна, поскольку продуценты БЦ более требовательны к составу питательных сред, следовательно, данные по доброкачественности среды для дрожжей не могут быть экстраполированы на целлюлозосинтезирующие микроорганизмы .

Материалы и методы исследования

ЛЦМ мискантуса был получен обработкой разбавленным раствором азотной кислоты на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН и имел следующий состав (%, в пересчете на а.с.в.): массовая доля кислотонерастворимого лигнина - 10,6, массовая доля золы - 4,8, массовая доля целлюлозы по Кюршнеру - 86,7, массовая доля пентозанов - 7,9.

Ферментативный гидролиз ЛЦМ мискантуса проводился в ферментере объёмом 11 л в водной среде при 47 ± 2 °С в течение 72 ч с помощью ферментных препаратов Целлолюкс-А (0,04 г/г субстрата) и Брюзайм BGX (0,1 мл/г субстрата), активная кислотность поддерживалась на уровне 4,7 ± 0,2 с помощью гидроксида аммония и ортофосфорной кислоты, начальная концентрация субстрата составила 60 г/л, более подробно методика описана в работе .

Полученный ферментативный гидролизат отфильтровывался от остатков субстрата под вакуумом. Гидролизат представлял собой прозрачную жидкость рыжего цвета с кислым запахом, активная кислотность 4,7 ед. рН. Общее количество редуцирующих веществ (РВ) составило 49,0 г/л, из них ксилозы - 2,8 г/л. В отфильтрованный ферментативный гидролизат ЛЦМ из мискантуса вносился охлажденный настой чая (1 л дистиллированной воды доводили до кипения, добавляли сухой черный байховый чай, проводили экстракцию в течение 15 мин, охлаждали и отфильтровывали). При этом питательная среда стандартизовалась по содержанию РВ от 20 до 25 г/л и по содержанию экстрактивных веществ чая от 1,6 г/л до 4,8 г/л .

В качестве продуцента для биосинтеза БЦ использовалась симбиотическая культура Мedusomyces gisevii Sa-12. Предварительно проводилась адаптация культуры на исследуемой питательной среде. Инокулят вносился в питательные среды в количестве 10 % от объема питательной среды, культивирование проводилось в статических условиях при 27 °С в течение 24 суток. Условия культивирования выбраны на основании ранее проведённых работ .

Микробиологические показатели (количество дрожжей и уксуснокислых бактерий) контролировались с использованием микроскопа B-150 OPTIKA. Прирост пленки БЦ оценивался гравиметрическим методом (весы лабораторные аналитические Explorer EX-224), уровень активной кислотности контролировался с помощью иономера (иономер И-160 МИ). Концентрация РВ контролировалась спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO-2804», США) с использованием динитросалицилового реактива, концентрация ксилозы определялась по стандартной методике, которая основана на образовании фурфурола из пентозанов.

Структура бактериальной целлюлозы была исследована на инфракрасном спектрофотометре «Инфралюм ФТ-801» в таблетках KBr.

Результаты исследования и их обсуждение

Изменение количества дрожжей и уксуснокислых клеток в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса представлено на рис. 1, изменение уровня активной кислотности в процессе культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 - на рис. 2.

Концентрация клеток дрожжей в питательной среде в процессе культивирования оказалась на порядок выше, чем уксуснокислых бактерий. Для дрожжей лаг-фаза не наблюдалась, увеличение концентрации клеток происходило с 0 по 12 сутки, после 12 суток происходила фаза отмирания. Для уксуснокислых бактерий наблюдалась лаг-фаза, до 8 суток их количество увеличивалось, с 8 по 10 сутки количество клеток оставалось постоянным, после 10 суток происходила фаза отмирания.

Рис. 3. Зависимость концентрации РВ и выхода БЦ от продолжительности культивирования

В процессе культивирования симбиотической культуры Мedusomyces gisevii в питательной среде в результате действия защитного механизма накапливаются промежуточные продукты гликолиза: уксусная, глюконовая кислоты, этанол и глицерин , косвенно об их накоплении можно судить по изменениям рН. Начальная активная кислотность питательной среды составляла 4,0, до шестых суток культивирования значение pH понизилось до 3,8. Далее в процессе культивирования значение активной кислотности среды повышалось до 5,9. Повышение активной кислотности не характерно для данного продуцента, однако похожая зависимость описана при культивировании продуцента Gluconacetobacter xylinus CH001 на кислотном гидролизате мискантуса .

На рис. 3 представлена зависимость концентрации РВ и выхода БЦ от продолжительности культивирования.

Константа скорости утилизации субстрата рассчитана по формуле :

где Ку.с. - константа утилизации субстрата, сут-1; S1, S2 - концентрация РВ в начальный и конечный моменты времени; t1, t2 - начальный и конечный моменты времени, сутки.

Рис. 4. Ик-спектр образца БЦ

Утилизация субстрата происходила в два периода: с 0 по 6 сутки культивирования константа скорости утилизации субстрата составила 0,234 сут-1, со 6 по 24 значение снизилось в 12 раз и составило 0,020 сут-1. Быстрая утилизация РВ с 0 по 6 сутки связано с потреблением субстрата микроорганизмами и их активным размножением. Со 6 по 24 сутки РВ медленно расходуются на поддержание жизнедеятельности микроорганизмов.

Гидролизат ЛЦМ мискантуса преимущественно состоит из глюкозы, концентрация ксилозы в нулевой момент времени составила 1,2 г/л. На 7 сутки культивирования общая концентрация РВ составила 4,9 г/л, при этом количество ксилозы в гидролизате практически не изменилось и составило 0,8 г/л. Через 24 суток культивирования концентрация РВ в питательной среде составила 3,4 г/л, а ксилозы - 0,3 г/л.

Скорость синтеза продукта (бактериальной целлюлозы) рассчитана по формуле

где Кс.п. - константа синтеза продукта, сут-1; С1, С2 - масса продукта в начальный и конечный момент времени; t1, t2 - начальный и конечный моменты времени, сутки.

В первые сутки культивирования на поверхности питательной среды не наблюдалось четко выраженной гель-пленки БЦ. На вторые сутки культивирования образовалась тонкая гель-пленка БЦ. Основной прирост биомассы происходил с 2 по 6 сутки культивирования - выход БЦ увеличился с 1,1 % до 4,7 %; константа скорости синтеза продукта в этот период составила 0,363 сут-1. С 6 по 10 сутки выход БЦ вырос до 5,6 %, константа скорости синтеза продукта в этот период снизилась до 0,044 сут-1. Далее скорость синтеза БЦ снижается, стремясь к нулевому значению.

С 10 по 24 сутки выход БЦ снизился до 1 %, что указывает на идущие процессы деструкции, этот период совпадает с фазой отмирания дрожжей и уксуснокислых бактерий. Таким образом, на практике начало фазы отмирания микроорганизмов может служить критерием окончания процесса биосинтеза БЦ.

Ферментативный гидролизат ЛЦМ мискантуса не является благоприятной питательной средой для биосинтеза БЦ, наибольший выход БЦ составил 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход БЦ на синтетической питательной среде при культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 в аналогичных условиях - 9,0 % . Предположительно, это можно объяснить способом предобработки исходного сырья и присутствием примесей в ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса, которые могут ингибировать биосинтез БЦ. Таким образом, доброкачественность ферментативного гидролизата ЛЦМ мискантуса для биосинтеза этанола не является гарантией доброкачественности для биосинтеза БЦ, что обусловлено большой требовательностью к качеству питательных сред симбиотических продуцентов Мedusomyces gisevii Sa-12 по сравнению с Saccharomyces сerevisiae. Можно предположить, что для успешного биосинтеза БЦ следует использовать более чистые субстраты, например техническую целлюлозу мискантуса.

На рис. 4 представлен ИК-спектр образца БЦ, синтезированного на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса.

В инфракрасном спектре образца БЦ присутствует интенсивная полоса при 3381 см-1, которая указывает на валентные колебания OH-групп. Менее интенсивная полоса при 2917 см-1 обусловлена валентными колебаниями групп CH2, CH. В спектре БЦ полосы в диапазоне 2000-1500 см-1 принадлежат деформационным колебаниям OH-групп прочно связанной воды. Слабые полосы поглощения в диапазоне: 1430-1370 см-1 обусловлены деформационным колебаниям групп CH2; 1360-1320 см-1 - деформационные колебания групп OH в CH2OH. Полосы при 1281 и 1235 см-1 указывают на деформационные колебания OH-групп в спиртах. Полоса при 1204 см-1 указывает на деформационные колебания OH-групп. Полосы поглощения в области 1000-1200 см-1 обусловлены в основном валентными колебаниями C-O-C и C-O в спиртах . Таким образом, методом ИК подтверждено, что БЦ, полученная на ферментативном гидролизате ЛЦМ, является чистым соединением, содержащим только целлюлозу.

Исследован процесс биосинтеза БЦ симбиотической культурой Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном гидролизате ЛЦМ мискантуса. Основная утилизация субстрата происходит за 6 суток культивирования, константа утилизации субстрата составляет 0,236 сут-1. Установлено, что численность уксуснокислых бактерий в процессе культивирования на порядок меньше, чем дрожжей, и через 10 суток составляет 1,1 КОЕ/мл. Показано, что на практике начало фазы отмирания симбиотических микроорганизмов может служить критерием окончания процесса биосинтеза, так как эта фаза совпадает с процессом деструкции БЦ. Показано, что ферментативный гидролизат ЛЦМ мискантуса не является доброкачественной питательной средой для биосинтеза БЦ: выход БЦ на 10 сутки культивирования составляет 5,6 %, что в 1,6 раз меньше, чем выход БЦ на синтетической питательной среде, а на 24 сутки выход падает до 1,0 %, то есть БЦ подвергается деструкции. С помощью инфракрасной спектроскопии установлено, что БЦ является чистым соединением, содержащим только целлюлозу.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-19-01054).

Библиографическая ссылка

Гладышева Е.К. БИОСИНТЕЗ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ НА ФЕРМЕНТАТИВНОМ ГИДРОЛИЗАТЕ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО МАТЕРИАЛА МИСКАНТУСА // Фундаментальные исследования. – 2017. – № 9-2. – С. 290-294;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=41742 (дата обращения: 13.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Процессы образования микрофибрилл целлюлозы (и вообще биосинтеза целлюлозы) могут протекать внутри или вне клеток. Внутриклеточные процессы являются в полной мере биохимическими и включают серию сложных превращений, в результате которых продукты жизнедеятельности клеток (растений, животных, микроорганизмов) превращаются в активированную форму глюкозы, после чего глюкоза может войти в состав инертной, нерастворимой, устойчивой микрофибриллы. Насколько известно, все эти процессы происходят внутри клетки пли в мембране ее цитоплазмы; они подробно описаны в предыдущем разделе. Однако имеются данные, показывающие, что в действительности включение остатков глюкозы в микрофибриллу происходит вне мембраны цитоплазмы. Следовательно, эти процессы, как биохимические, так и физические, протекают вне клетки и ниже будут рассмотрены только такие процессы.[ ...]

Полученные им данные подтверждают, что в результате жизнедеятельности клеток A. xylinum происходит превращение экзогенного субстрата в целлюлозу и двуокись углерода, причем исходным веществом для синтеза целлюлозы, вероятно, является фосфат гексозы. Глязер впервые осуществил биосинтез целлюлозы в бесклеточной системе из A. xylinum. Нерастворимый фермент, осажденный центрифугированием (lOOOOOg), катализировал перенос остатков D-глюкозы от УДФ-D-глюкозы, меченной изотопом 14С. В результате образовывался радиоактивный полисахарид, нерастворимый в воде и щелочи. Методом ферментативного гидролиза в присутствии целлюлазы Myrotheciurn verrucaria, а также методом частичного кислотного гидролиза и выделения целлобиозы, обладавшей постоянной радиоактивностью, было установлено, что синтезированный полисахарид является целлюлозой. Образованию нерастворимой целлюлозы способствовало добавление высокомолекулярных, растворимых целлодекстринов. Ферменты, ответственные за синтез целлюлозы, были отделены от ферментов, катализирующих образование УДФ-Б-глюкозы из a-D-глюкозо-1 -фосфата. Однако содержание в целлюлозе радиоактивной глюкозы составляло только 1-2% того количества, которое содержится в образующейся целлюлозе, когда субстратом является УДФ-0-глюкоза-14С. При использовании УДФ--глюкозы-иС в целлюлозе содержалось приблизительно такое же количество радиоактивной глюкозы, как и в целлюлозе, синтезировапиой Глязером. Барбер также установил, что донором D-глюкозы-НС при биосинтезе целлюлозы может служить и ТДФ-0-глюкоза-14С, но она менее активна, чем УДФ-0-глкжоза-14С. Целлюлоза не образовалась, когда в качестве субстрата применили другие нуклеотиды.[ ...]

Перенос Б-глюкозного остатка от нуклеозиддифосфат-О-глюкозы на глюколииид происходит вблизи мембраны или па мембране цитоплазмы, затем О-глюкоза, соединенная с липидным компонентом, мигрирует за пределы клетки. В этом процессе липидный компонент осуществляет транспортную функцию, делая возможным проникновение глюкозы из клетки во внешнюю сферу, где глюкоза иолимеризуется с образованием целлюлозы.[ ...]

Изучение процессов включения в состав полисахаридов и последующего выделения из них радиоактивной глюкозы или сахарозы, протекающих в тканях корней пшеницы, также подтвердило обратимость биосинтеза целлюлозы и присутствие в клетках корней активной целлюлазы (или целлюлаз), вызывающей деструкцию микрофибрилл после их образования. Эти данные опровергают ранее установившийся взгляд на целлюлозу, как на вещество инертное в процессах метаболизма. Полученные этими исследователями данные не позволяют, однако, сделать каких-либо других выводов, поскольку «не имеется достаточного количества сведений для объяснения механизма обмена».[ ...]

Другой фермент , способный образовывать на субстрате ГДФ-0-глюкозы-14С полисахарид, по свойствам идентичный природной целлюлозе, обнаружен в быстро растущих корневых тканях маша, гороха, пшеницы, во фруктовой мезге, а также семенах и волокнах незрелых хлопковых коробочек . Роль фермента, синтезирующего целлюлозу, заключается в переносе активированных D-глю-козных остатков на растущую полисахаридную цепь. Этот фермент был очень специфичен в случае ГДФ-Г)-глюкозы, но не проявлял специфичности при использовании других меченных изотопом 14С нуклеотидов глюкозы, у которых агликонами были урацил, аденин, тимин или цитозин, и такие нуклеотиды не могли служить субстратами при биосинтезе целлюлозы.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Целлюлоза широко распространена в живой природе: ее молекулы являются самым распространенным биополимером на нашей планете. Это вещество - основной компонент растительных волокон, имеющее огромное значение как для глобальной экосистемы Земли, так и для различных областей промышленного производства. Растительные клетки долго хранили секрет биосинтеза этого полимера, но методы молекулярной генетики и биоинформатики позволили пролить свет на процессы его формирования. Статья посвящена истории открытия и исследования биосинтеза целлюлозы, а также последним результатам моделирования молекулярных комплексов растений, ответственных за биосинтез целлюлозного полимера.

Растительные волокна очень давно и прочно вошли в нашу повседневную жизнь. Мы встречаемся с ними, когда читаем газету, надеваем джинсы или садимся за свой рабочий стол. Столь разнообразные по свойствам материалы как хлопковая ткань, бумага или древесина весьма схожи по химической структуре и представляют собой растительные волокна или целлюлозу .

Исследования археологов показывают, что люди используют их со времен палеолита, а это значит, что уже более 30 тыс. лет целлюлоза была материальным носителем нашей культуры. Изобретение и широкое распространение книгопечатания дало сильный толчок в развитии человеческой цивилизации, который не обошелся без целлюлозы. Возможно, когда-нибудь мы полностью перейдем на электронные книги и журналы, но пока этого не произошло, а школьники и студенты хоть иногда пользуются бумажными учебниками и тетрадками, целлюлоза по-прежнему является важным и необходимым участником процесса накопления и передачи знаний. Но кто же те трудолюбивые «ткачихи», которые все это время изготавливали для нас растительные волокна? Что собой представляют и как работают растительные фабрики, производящие столь качественную продукцию в огромных количествах? Ответить на эти вопросы оказалось непросто.

Впервые в поле зрения ученых целлюлоза попала во второй половине 17 века, когда Роберт Гук сфокусировал свой микроскоп на препарате среза пробкового дерева (рис. 1). Тогда английский исследователь увидел сетчатую структуру среза, отдельные ячейки которой он и назвал клетками (от лат. cellula; еще не целлюлоза, но уже близко даже по звучанию слов). Сейчас мы знаем, что Гук наблюдал не сами клетки, а только перегородки между ними или, как говорят ученые, клеточные стенки .

Намного позднее, в первой половине 19 века, французский химик Ансельм Пайя анализировал химический состав перегородок, которые почти двести лет тому зарисовал Гук. Он установил, что основную их часть составляет волокнистое вещество, которое Ансельм Пайя назвал целлюлозой . Изучение структуры этого вещества показало, что оно представляет собой длинные ниточки или, точнее сказать, цепочки, состоящие из одинаковых повторяющихся звеньев, которыми являются более мелкие молекулы глюкозы. По мере накопления научных фактов, ученые обнаружили интересную закономерность, касающуюся целлюлозы. Растения способны синтезировать целлюлозу и откладывать ее в составе оболочек собственных клеток, а животные же никогда (если быть совсем точным, то за очень редким исключением) не образуют этот полимер. Целлюлоза оказалась таким веществом, которое кардинальным образом отличает растения от животных.

По мере развития биологии ученых уже интересовали не только вопросы описания живых организмов, их формы, окраски, но и то, как они функционируют, почему имеют ту или иную окраску, какими процессами это обеспечивается и как они протекают в клетках живых организмов. К середине 20-го века ученым стало ясно, что если в растениях или животных присутствует какое-либо вещество, то, значит, есть биохимическая реакция, в которой это вещество синтезируется, и фермент, обеспечивающий эту реакцию. Исследователи приступили к изучению метаболизма живых организмов.

В изучении метаболизма целлюлозы ничего не предвещало серьезных трудностей. Этот полимер устроен достаточно просто, поэтому предполагалось, что и процессы, обеспечивающие его накопление, не очень сложны. Целлюлозу рассматривали как элемент клеточной стенки растений, а саму клеточную стенку представляли как «картонную коробку» для живого содержимого клетки. Образование целлюлозы учёные представляли как процесс постепенного утолщения стенок «коробки» (что-то подобное наслоению накипи на стенках чайника, если его долго не чистить). Однако в действительности все оказалось значительно сложнее. Многочисленные попытки изучить реакцию накопления целлюлозы и выделить растительный фермент не увенчались успехом. Все большее число экспериментальных данных указывало, что при биосинтезе целлюлозы задействован целый комплекс ферментов, составляющий сложную систему. Складывалась парадоксальная ситуация - для синтеза достаточно простого, с точки зрения биохимии, вещества в живой клетке задействованы очень сложные механизмы. Эти процессы оказались настолько сложны, что до сих пор ученые не могут воспроизвести в пробирке биосинтез целлюлозы у растений, хотя многое здесь уже понятно благодаря бактериям, а также методам генетики и биоинформатики.

Как это часто бывало в науке 20 века, бактерии оказывали помощь в изучении сложных биологических процессов. Клетки этих мельчайших живых организмов устроены проще, поэтому и изучать их легче. В случае с целлюлозой микробы также сыграли немаловажную роль. Следует отметить, что в целом для бактерий не свойственно образование целлюлозы, однако некоторые виды, среди которых (рис. 2, видео), способны синтезировать это вещество .

Рисунок 2. Бактерии : колонии, образующиеся в лабораторных условиях при росте на плотных питательных средах (а ) и сложное микробное сообщество, на кухне чаще называемое чайным грибом (б ).

Видео. Биосинтез целлюлозы бактериями (видеомикроскопия в режиме реального времени)

Для клеток бактерий удалось сделать то, что не удавалось сделать для растительных клеток, а именно: выделить фермент, который синтезирует целлюлозу. Проанализировав бактериальную целлюлозосинтазу (именно так называется фермент, который синтезирует целлюлозу), ученые установили ключевой участок молекулы фермента, где происходит «нанизывание» отдельных звеньев глюкозы в длинную цепочку целлюлозы . Эта информация была очень ценной для исследователей, поскольку позволяла по аналогии с бактериальными ферментами искать похожие ферменты растений. К тому же ученые очень хорошо знали, что подавляющее число ферментов (в том числе и целлюлозосинтаза) относится к белкам, а информация о структуре всех белков записана в генах посредством генетического кода. Другими словами, можно перевести «текст» генетического кода на язык белковых ферментов, а где начинается работа с генетическими последовательностями, там генетики могут подключиться к исследованию и предложить свою помощь.

Если невозможно выделить и изучать ферменты биосинтеза целлюлозы, то можно выделить и изучать гены, которые кодируют эти ферменты. Ведь с генами работать намного проще, чем с ферментами. А если ферменты, которые изучаются, имеют особенности в своей структуре, то информация об этих особенностях записана и в соответствующих генах. Поэтому можно сравнивать не только сами ферменты и искать в них интересующие участки, но и гены, которые их кодируют. Ученые использовали информацию о структуре бактериальных генов целлюлозосинтаз для поиска их растительных аналогов. Подход генетиков принес долгожданный успех в расшифровке секретов биосинтеза целлюлозы растениями. В 1996 году группе ученых во главе с Дж. Пеар удалось идентифицировать два гена целлюлозосинтаз хлопчатника и один ген риса . Это были первые открытые растительные гены, кодирующие эти ферменты. Располагая данными о структуре растительных генов, ученые смогли перевести генетическую информацию на язык белковой последовательности фермента. В свою очередь, анализ белковых последовательностей при помощи биоинформатических алгоритмов позволил смоделировать структуру растительных целлюлозосинтаз (рис. 3).

Рисунок 3. Структура целлюлозосинтазы хлопчатника. а - схема вторичной структуры: шесть β-слоев обозначены стрелками, а тринадцать α-спиралей бочонками. б - пространственная структура молекулы: подписаны α-спирали и β-слои с числом, обозначающим их последовательность в аминокислотной цепочке белка (в направлении от N - к С -концу). α-Спирали, выделенные серым цветом , и β-слои, отмеченные желтым , входят в состав каталитического центра фермента.

Оказалось, что для появления способности к синтезу целлюлозы, шесть растительных ферментов должны объединиться вместе, а такой шестикратный комплекс, в свою очередь, должен объединиться с шестью подобными ему шестикратными комплексами. Растительная целлюлозосинтаза оказалась очень «компанейским» ферментом, который работает только в команде, составляющей в конечном итоге 36 отдельных ферментов (рис. 4).

Рисунок 4. Строение целлюлозосинтазного комплекса. а - модель структуры комплекса. Шесть отдельных ферментов образуют шестикратные комплексы, которые, в свою очередь, формируют целлюлозосинтезирующий комплекс. Каждый фермент синтезирует одну цепочку целлюлозы, которые, соединяясь вместе, формируют целлюлозную микрофибриллу. б - микрофотография внутренней поверхности оболочки растительной клетки табака, полученной с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Целлюлозосинтезирующий комплекс (в окружности) связан с микрофибриллой целлюлозы (отмечена стрелкой ). Риска: 200 нм.

Объединившись особым образом, эти тридцать шесть ферментов включаются в биологическую мембрану и только тогда начинают нанизывать отдельные звенья глюкозы в длинную цепочку целлюлозного полимера. Растительная целлюлозосинтаза - это тридцать шесть «ткачих», которые по шесть рассажены в шесть отдельных команд. Каждая ткачиха ткет свою нить - отдельную цепочку целлюлозы, - которая сплетается вместе с другими и дает упругую косичку из 36 отдельных ниточек. Такая косичка называется целлюлозной микрофибриллой . Все ткачихи должны работать слаженно, чтобы косичка получилась равномерной и без перекосов. Если каждая ниточка микрофибриллы на месте и косичка сплетена ровно, без брака, то ученые говорят о кристаллической форме целлюлозы, а если косичка где-то расплелась, растрепалась, - то это аморфная целлюлоза (рис. 5).

Рисунок 5. Структурная модель микрофибриллы целлюлозы. а - Микрофибрилла целлюлозы, состоящая из 36 целлюлозных цепочек. б - Несколько цепочек целлюлозы, образующие кристаллическую область. в - Цепочка молекулы целлюлозы, состоящая из «звеньев» глюкозы.

Хорошо сплетенная целлюлозная микрофибрилла - отличная опора для всего растения, а среди них встречаются настоящие гиганты. Хорошо уложенные «косички» целлюлозы образуют прочный и длинный опорный скелет, который надежно удерживает и многовековой дуб, и раскидистую иву. А ведь, по большому счету, эта прочность рождается благодаря стараниям тридцати шести искусных ткачих!

Исследования молекулярных комплексов, ответственных за биосинтез целлюлозы, важны и перспективны, поскольку имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. С одной стороны, исследование биосинтеза целлюлозы позволяет нам познавать процессы роста и развития растительной клетки, понять механизмы обмена информацией между клетками и окружающей средой, другими словами - узнать больше о том динамическом равновесии, называемом жизнью. А с другой стороны, исследование биологических процессов, которые лежат в основе биосинтеза целлюлозы, открывает широкие перспективы влияния на формирование растительного волокна, замены и моделирования его свойств под запросы конкретной области производства.

Литература

  1. L. Sethaphong, C. H. Haigler, J. D. Kubicki, J. Zimmer, D. Bonetta, et. al.. (2013). Tertiary model of a plant cellulose synthase . . 93 , 12637-12642;
  2. Monika S. Doblin, Isaac Kurek, Deborah Jacob-Wilk, Deborah P. Delmer. (2002). Cellulose Biosynthesis in Plants: from Genes to Rosettes . Plant and Cell Physiology . 43 , 1407-1420;
  3. A. J. Bowling, R. M. Brown. (2008). The cytoplasmic domain of the cellulose-synthesizing complex in vascular plants . Protoplasma . 233 , 115-127;
  4. Cosgrove D.J. Cell Walls: Structure, Biogenesis, and Expansion . In: Plant Physiology (2nd Edition) / ed. by Taiz L. and Zeiger E. 2006. P. 313–338.

В цикле Кальвина - Бенсона образуется, как уже отмечалось выше, фруктозо-6-фосфат (F-6-P). Этот гексозофосфат может под действием специфических ферментов превращаться в другие фосфорилированные гексозы, а именно в глюкозо-6-фосфат (G-6-P) и глюкозо-1-фосфат (G-1-P). Легко происходит и обратное превращение.

Из этих трех гексозофосфатов строятся затем цепи углеводных молекул, используемых для транспорта, хранения и в реакциях синтеза. Чтобы такие превращения могли произойти, гексозофосфаты предварительно должны быть активированы. Это обычно достигается в результате их присоединения к нуклеотидам - сложным кольцевым структурам, сходным с адениловой кислотой АТР. Продуктом такой реакции присоединения оказываются нуклеотидные производные моносахаридов, или нуклеотидсахара. Чаще других встречаются уридиндифосфоглюкоза (UDPG), образующаяся в реакции между уридинтрифосфатом (UTP) и глюкозо-1-фосфатом (G-1-P). Сам UTP образуется непрямым путем, в результате переноса фосфатной группы от АТР к UDP (уридиндифосфату).


Нуклеотиды АТР и UTP присутствуют во всех клетках, потому что они используются наряду с другими нуклеотидами в синтезе ДНК и РНК.

Сахара транспортируются по растению в виде сахарозы - дисахарида, состоящего из остатков глюкозы и фруктозы (рис. 5.2). Сахароза образуется в реакции между UDPG и F-6-P:


Равновесие этой реакции сильно сдвинуто в сторону синтеза сахарозы, чем обеспечивается возможность накопления данного дисахарида в значительных концентрациях. Для последующего использования сахароза должна предварительно подвергнуться расщеплению: фермент инвертаза катализирует ее гидролиз с образованием свободной глюкозы и фруктозы.


Энергия гликозидной связи в такой реакции растрачивается впустую, распределяясь между двумя молекулами. Поэтому если глюкозе и фруктозе предстоит распад в процессе дыхания или участие (в качестве сырья) в синтезе полисахаридов, то они должны предварительно вновь подвергнуться фосфорилирова- нию за счет АТР. Процессы синтеза и распада сахарозы наглядно показывают, что часто анаболические и катаболические реакции (реакции синтеза и распада) идут по разным путям.

Синтез крахмала и целлюлозы

Длинные полимерные цепи крахмала и целлюлозы построены из одних и тех же элементарных звеньев - остатков глюкозы, только соединенных по-разному. Это структурное различие обусловливает то, что два рассматриваемых полимера глюкозы (глюканы) существенно различаются по своей природе; крахмал, например, легко переваривается в организме человека" а целлюлоза совсем не переваривается. Главное же их различие состоит в том, что 1-й и 4-й углеродные атомы двух соседних остатков глюкозы соединены у крахмала α-связями, а у целлюлозы (β-связями (рис. 5.3). Крахмал представлен двумя формами: линейным полимером, или амилозой, не содержащим никаких других связей, кроме α-1,4-гликозидных, и разветвленным полимером, или амилопектином, в котором наряду с α-1,4-гликозидными связями имеются и 1,6-связи. Различие в характере связей определяет и неодинаковое пространственное расположение полимерных цепей. Крахмал - главный запасной полисахарид растения. Он нерастворим в воде и отлагается слой за слоем в крахмальных зернах, содержащихся в хлоропластах (см. рис. 2.20) или в лишенных хлорофилла лейкопластах запасающих тканей стебля, корней и семян. Иногда клетки запасающей ткани оказываются буквально забиты крахмальными зернами, которые легко в них выявить, поскольку они способны окрашиваться иодом в синий цвет. Будучи нерастворим в воде, крахмал в отличие от сахарозы и от гексоз не вызывает в клетках осмотического эффекта (см. гл. 6). Поэтому образование крахмала в клетках листа в периоды интенсивного фотосинтеза предотвращает подавление последнего, происходящее в результате накопления продуктов фотосинтеза. В темноте крахмал постепенно снова гидролизуется с образованием глюкозофосфата, который затем превращается в сахарозу, транспортируемую в другие части растения.


Рис. 5.3. Структура крахмала (А) и целлюлозы (Б) (С изменениями по J. Bonner, A. W. Galston. 1952. Principles of Plant Physiology, San Francisco, W. H. Freeman and Co.) Обратите внимание, что химические формулы крахмала и целлюлозы одинаковы, различаются же эти полисахариды пространственной ориентацией их кислородных мостиков. А. Крахмал, главный запасной полисахарид растения, построен из двух хорошо различимых компонентов: амилозы с ее длинными неразветвленными цепями из глюкозных звеньев и амилопектина, состоящего из большого числа коротких разветвленных цепей. Б. Целлюлоза, главный компонент первичной клеточной стенки, существует в виде длинных полимерных цепей. Цепи объединяются в мицеллярные тяжи, а последние - в микрофибриллы. Микрофибриллы, достаточно крупные для того, чтобы их можно было рассмотреть при помощи электронного микроскопа, составляют "основу" и "уток" клеточной стенки

Исходным продуктом для синтеза крахмала служит аденозиндифосфоглюкоза (ADPG), образующаяся из АТР и G-1-P:


Молекула крахмала строится путем постепенного добавления одного глюкозного остатка за другим в реакции ADPG с предобразованной глюкозной цепью:

При низком содержании сахарозы крахмал расщепляется и. переводится в сахарозу. Однако сначала он расщепляется до остатков глюкозы и к каждому из них присоединяется остаток фосфорной кислоты, т. е. образуется G-1-P, чем обеспечивается сохранение энергии связи:

Этот G-1-P может затем использоваться для синтеза сахарозы, который мы описали выше. В семенах и в некоторых других органах, в которых одновременно идет расщепление больших количеств крахмала, он распадается до дисахарида мальтозы (G-G) под действием аα-амилазы. Мальтоза затем распадается до глюкозы, из которой (для транспорта) вновь синтезируется сахароза. На этом втором пути в отличие от первого энергия связи не сохраняется, поэтому здесь для превращения глюкозы в глюкозо-6-P требуется АТР.


Целлюлоза, самый распространенный на Земле углевод, служит главным компонентом первичной клеточной стенки. Молекулы ее строятся подобно тому, как строятся молекулы крахмала, с тем, оцнако, отличием, что роль донора глюкозы играет другое нуклеотидное производное моносахарида - гуанозин- дифосфоглюкоза (GDPG) - и что связь между мономерными.звеньями принадлежит не к α-, а к β-типу.


В некоторых случаях донором глюкозы для синтеза целлюлозы может быть и UDPG.

В организме высших растений целлюлоза расщепляется редко (если не считать распада, обусловленного деятельностью микробов). Два известных исключения из этого правила касаются клеток в отделительной зоне листа, образующейся перед сбрасыванием листьев, и сосудов ксилемы, у которых поперечные стенки растворяются. В отделительной зоне листа фермент целлюлаза разрушает клеточные стенки, расщепляя содержащуюся в них целлюлозу до отдельных мономерных единиц, т. е. до глюкозы. Клеточные стенки, ослабленные этим процессом, в конце концов разрываются, и лист сбрасывается.

Целлюлозные микрофибриллы в клеточной стенке скреплены при помощи матрикса из смешанных полисахаридных цепей, главным образом ксилоглюканов и арабиногалактанов (см. рис. 2.31). (Ксилоза и арабиноза - пятиуглеродные сахара (пентозы), а галактоза - гексоза, родственная глюкозе.) Эти полисахариды синтезируются также из предшественников, нуклео- тидсахаров, преимущественно в диктиосомах. Отшнуровывающиеся от диктиосом пузырьки в конце концов сливаются с плазмалеммой и таким путем передают свое содержимое формирующейся клеточной стенке.

Итак, все полисахариды легко переходят один в другой, но синтез их всегда идет через стадию нуклеотидсахаров, тогда как распад совершается более прямым путем.


Close